J Exp Med：烟酰胺单核苷酸转移酶（NNT）通过维持Fe-S蛋白功能而适度NSCLC线粒体代谢

生物白血病展现借助于借助于弱小而适合于的叶绿体代谢物，意味著是由肝组织的高氧性造成的。由于活性氧(ROS)的生成是这种代谢物的副产物，因此所需以酪氨酸赖氨酸二核苷灶酸磷灶酸(NADPH)的表达方式来减小锌应当激，以应当对这种叶绿体活性的提升。酪氨酸单核苷灶酸转移蛋白酶(NNT)可通过NADPH的生成来可维持叶绿体的抗癌能够，但其在非小细胞核白血病(NSCLC)中时会的效用尚未确切。本数据库控制系统性辨认借助于NNT的表述在白血病血清框架中时会微小提升了的逐步形成和摧残性。另则有，实质性数据库控制系统性辨认借助于NNT遗漏时会避免叶绿体新功能障碍，这与锌应当激的大量减小就其，而是以铁硫抗原的活性减小为标志。这些弱点与NADPH的有效性和ROS的造就有关，这得借助于结论NNT在大大降低这些极为重要抗原辅因子的锌中时会起着极为不可或缺。

实验室设计

许多常用的白血病血清框架是运用C57BL6/J血清的饲养策略而确立。新奇的是，这些血清可携带纯合则有显子7-11的框内遗漏以及叶绿体中时会NntDNA的错义突变避免非新功能抗原的表述。因此，可以运用这种自然遗漏的等位基因(NntΔex7-11)来口碑NNT对白血病频发的冲击。

首先，适用Kras突变(LSL-KrasG12D/+)惹来的白血病框架来检测Nnt表述对白血病频发的冲击。可携带Cre重组蛋白酶的腺病毒感染LSL-KrasG12D/+血清，可诱导KrasG12D在肝结缔组织中时会的表述和肝肝癌的逐步形成。运用LSL-KrasG12D/+血清和C57BL6/J血清交配消除Nnt+/+表述血清或NntΔex7-11/Δex7-11表述血清(布1A-1B)。该框架中时会Nnt的表述避免Cre重组蛋白酶诱发的承受较快3个月(布1C-1D)。然后，运用Kras突变与p53遗漏同时表述(LSL-KrasG12D/+；Trp53flox/flox，也称做KP)确立白血病框架。Nnt的表述不会改变Cre诱导的KP血清的成功率(布1E)。新奇的是，在这个框架中时会，p53的遗漏去除了Nnt表述对白血病逐步形成的冲击，并且无论Nnt表述如何，实验室最终都依赖于微小的承受(布1F)。白血病承受比重的量化在相异表现型血清之间不会相似之处(布1G-1H)。

虽然相异表现型血清之间的承受不会相似之处，但确实观察到框架中时会摧残性的相似之处。我们辨认借助于Nnt+/+血清中时会51.3%的为3级(肝癌)或以上，而NntΔex7-11 / +和NntΔex7-11 /Δex7-11血清中时会仅有36.5%和38.8%的是高级(布1I)。Nnt+/+血清频发4级的频率特别是在减小，证明了摧残性的叠加(布1J)。总之，这些数据库得借助于结论Nnt加强了白血病的频发和摧残。

2 NNT的遗漏不冲击叶绿体中时会硫氧还抗原(TXN)的抗癌基础

为了实质性审核NNT对白血病生态学的冲击，首先审核shRNA妨碍NNT抗原的表述，之外4个表述NNT抗原的NSCLC细胞核系 (A549, H1299，H2009和PC9)和不表述NNT抗原的H441细胞核(布2A)。妨碍NNT抗原表述抑制NSCLC细胞核的细胞分裂能够(布2B)。并且辨认借助于比较慢病毒感染4几天后NNT的降至减小了H2009和PC9细胞核的生存能够(布2C)。此则有，H441细胞核的细胞分裂免受NNT的冲击。

通常忽视NNT有效地NADPH的转化成能够，从而可维持叶绿体抗原抗癌控制系统处于转化成情况下(布2D)。妨碍NNT减小了H1299、H2009和PC9细胞核中时会NADPH: NADP+的比重 (布2E)。比较慢病毒感染4几天后叶绿体中时会H2O2特别是在减小(布2F)，所以NNT对H2O2止痛现实生活很不可或缺。

为了相符这些叶绿体ROS的减小确实与叶绿体抗癌控制系统有关，于是运用Western blotting审核叶绿体中时会过锌物抗原3(PRDX3)的锌情况下。H2O2通过PRDX3止痛，即一对半乳糖二硫键诱导PRDX3逐步形成阴离子，并且必须通过TXN转化成这些半乳糖二硫键才能转化成PRDX3的抗癌新功能。PRDX3阴离子的造就是PRDX3锌的标志，是叶绿体锌应当激的常用标志物。

奥马罗芬是一种TXN转化成蛋白酶(TRXR)胺，虽然奥马罗芬的病人时会避免PRDX3抗原大量锌，但NNT的遗漏并不会减小PRDX3的锌(布2G)。此则有，NNT的遗漏也不会减小叶绿体TXN2或TRXR2的抗原总体。总之，这些结果得借助于结论NNT在NSCLC细胞核细胞分裂能够上发挥不可或缺效用，但NNT活性的夺去这不想负面影响叶绿体TXN抗癌控制系统，也不想惹来微小的锌应当激。

3 NNT的遗漏时会负面影响叶绿体的锌能够

鉴于NNT在IMM中时会的定位及其冲击膜上水分子能量密度和转化成能够，于是试布探讨NNT对叶绿体锌代谢物确实不可或缺。首先，适用海马细胞核则有能量密度控制系统性仪进行时叶绿体压力测试者，审核NNT遗漏对一般叶绿体锌新功能的冲击。结果辨认借助于NNT遗漏细胞核的耗氧量(OCR) 随叶绿体胺的依次传递而被减小(布3A)。众所周知的是，NNT遗漏细胞核的第二大气管能够在不具体来说非耦合气管的情况下特别是在减小(布3B)。这指引叶绿体锌弱点与NNT对水分子梯度的冲击就其。鉴于NNT遗漏微小冲击气管能够，于是检测NNT遗漏的H441细胞核确实比NNT表述细胞核具有愈来愈少的锌和愈来愈超强的糖酵解能够。这解释这些细胞核在不会NNT的情况下意味著通过叶绿体NADPH可能而可维持叶绿体的新功能。

叶绿体的锌代谢物具体来说ETC的新功能，ETC由诱导铁硫的Fe-S抗原一锌氮组合而成。考虑到Fe-S抗原一锌氮的转化成自由基现实生活所需NADPH，于是数据库控制系统性NNT妨碍后叶绿体气管新功能的减少确实与Fe-S抗原相关。叶绿体压力测试者可以对气管新功能进行时一般化的控制系统性，但不可以对单个ETC一锌氮成分进行时审核。因此，作者进行时了愈来愈为各个领域的实验室来控制系统性Fe-S抗原依赖的气管相关一锌氮(I, II, III)。结果辨认借助于，基于一锌氮I(灶酸和苹果灶酸)的摄取，在NNT妨碍后一锌氮I-III的活性特别是在减小(布3C)。此则有，NNT弱点细胞核微小减小了琥珀灶酸的OCR，得借助于结论减小了琥珀灶酸脱氢蛋白酶(SDH)活性和一锌氮II-III容量(布3D)。避免这一现象的不可或缺原因是SDH在ETC和TCA循环中时会扮演着双重角色。

除了通过ETC可维持电子容量则有，Fe-S抗原还可维持对锌代谢物至关不可或缺的其他抗原蛋白酶的新功能。为了相符NNT确实参与其他Fe-S抗原的新功能，作者审核了TCA循环中时会Fe-S抗原——顺藁本灶酸蛋白酶(ACO2)的活性。结果辨认借助于妨碍NNT特别是在减小了NSCLC细胞核系中时会ACO2的活性(布3E)。ACO2活性的减小意味著时会摧残TCA循环，进而减小驱动ETC容量的硫化物物质的生成。为了补充非小细胞核白血病中时会ACO2新功能的控制系统性，于是口碑Nnt表述对KP白血病中时会ACO2活性的冲击。结果得借助于结论，Nnt+/+血清中时会Aco2活性微小高于NntΔex7-11/+ 和NntΔex7-11/Δex7-11中时会的，缺乏Nnt的展现借助于借助于平均的活性(布3F)。

4 则有源性NADPH在NNT遗漏后可维持Fe-S抗原新功能

为了相符与妨碍NNT相关的叶绿体Fe-S抗原新功能的减小确实与NADPH:NADP+的减小有关，我们试布提供一种叶绿体NADPH的则有源性可能。为了实现这一目标，我们选择了大肠杆菌叶绿体中时会NADH激蛋白酶pos5p，它可以磷灶酸化NADH而消除NADPH。虽然pos5p以前在细菌中时会也有则有源表述，但据我们所知，pos5p还不会被引入两栖类控制系统。为了检测我们确实能够有效地在生物NSCLC细胞核的叶绿体中时会表述pos5p抗原，我们对大肠杆菌抗原进行时了标示，使其包含HA-tag。Western blot结果显示，在H1299、H2009和PC9细胞核的叶绿体中时会成功表述了HA-tag标示的pos5p抗原(布4A)。选择这些细胞核系是为了审核pos5p复原和NNT遗漏相关的Fe-S抗原弱点的能够，辨认借助于妨碍NNT后对它们造成很比较严重的冲击。

pos5p的表述挽救了细胞核中时会妨碍NNT后惹来的NADPH: NADP+比重的减小(布4B)。这与表述pos5p细胞核中时会pos5p扰后气管双链适合于社区活动的减小有关(布4C和4D)。此则有，pos5p的表述几乎挽救了NNT妨碍后ACO2活性的减少(布4E)。总之，这些数据库得借助于结论可维持NNT表述遗漏时NADPH的总体可以保护措施NSCLC细胞核中时会Fe-S抗原的新功能。

5 NNT的遗漏不想摧残Fe-S抗原的转化成自由基

考虑到叶绿体则有源性NADPH能够减慢NNT遗漏相关Fe-S抗原的弱点，并且NADPH是高效可维持Fe-S抗原转化成自由基的必备条件，因此我们接下来试布相符NNT活性确实可维持这一现实生活。Fe-S抗原转化成自由基频发在一个由半乳糖脱硫蛋白酶(NFS1)和Fe-S支架抗原(ISCU)组合而成的多抗原一锌氮中时会。一锌氮中时会任何一种成分的遗漏都时会冲击转化成自由基，并且也与叶绿体弱点相关。因此，我们妨碍NFS1或ISCU表述来数据库控制系统性摧残Fe-S抗原转化成自由基后对气管双链和ACO2的冲击。

在H2009细胞核中时会，妨碍NFS1后特别是在减小灶酸/苹果灶酸自由基和琥珀灶酸自由基中时会气管双链一锌氮I-III的活性，而在PC9细胞核中时会只有一锌氮II-III活性被微小减小(布5A和5B)。另则有，两个细胞核系中时会，在灶酸/苹果灶酸和琥珀灶酸的效用下，妨碍ISCU表述后特别是在减慢了OCR(布5A和5B)。并且妨碍NFS1或ISCU后特别是在减小了细胞核系中时会ACO2活性(布5C)。新奇的是，NNT妨碍后所惹来的弱点与Fe-S抗原转化成自由基所需物质造成的弱点是同等不可或缺的(布5A-5C)。

为了证明Fe-S抗原弱点对NSCLC细胞核的叶绿体代谢物有新功能性冲击，我们对妨碍NNT或ISCU细胞核进行时基于定量法定量-高分辨质谱(LC-HRMS)的代谢物组学数据库控制系统性。 对这些细胞核TCA循环的代谢物物进行时控制系统性，结果显示大多数中时会间产物的丰度频发了特别是在叠加(布5D)。这些都得借助于结论了锌代谢物的比较严重摧残和Fe-S抗原新功能弱点的一致性。具体地说就是妨碍NNT和ISCU表述后，灶酸、苹果灶酸和富马灶酸被耗损。NNT遗漏细胞核中时会的柠檬灶酸总体被耗尽，但妨碍ISCU细胞核中时会并不会此结果。另则有，妨碍ISCU细胞核中时会琥珀灶酸大量造就，而在NNT遗漏细胞核中时会则不依赖于此现象(布5D)。

除了Fe-S抗原ACO2和SDH则有，TCA循环还具体来说另一种叶绿体Fe-S抗原——硫辛灶酸制备蛋白酶(LIAS)的新功能。LIAS对于硫辛灶酸的制备以及不可或缺硫辛灶二氧化双键的标量都非常极为重要，硫辛灶二氧化双键由PDH (E2)和α-酮戊二灶酸脱氢蛋白酶(二氢硫辛酰胺S-琥珀酰转移蛋白酶，DLST)组合而成。LIAS对Fe-S抗原转化成自由基的摧残特别极端，因为其Fe-S簇在转化成现实生活中时会被耗损掉，这就敦促不断地进行时抗原互换。事实上，妨碍NFS1和ISCU表述时会大量减小PC9细胞核中时会PDH-E2和DLST的脂化，然而妨碍NNT对抗原脂化无冲击(布5E)。总的来说，这些数据库得借助于结论，NNT避免蛋白酶和代谢物弱点，它们的弱点与Fe-S抗原转化成自由基的摧残相关，但NNT不意味著直接冲击这一现实生活。这解读借助于妨碍NNT和ISCU后对TCA循环消除类似但又相异的冲击。

6 NNT的遗漏摧残脂类代谢物

除了耗损TCA循环则有，NNT弱点细胞核的LC-HRMS代谢物组学控制系统性得借助于结论脂类代谢物失调。妨碍NNT加强长双链脂肪酰基乙酰的大量造就，而长双链脂肪酰基乙酰是脂类β-锌的底物(布6A)。鉴于在NNT弱点细胞核中时会依赖于气管控制系统弱点，我们推测这些酰基乙酰的减小是由于脂类锌减小。我们辨认借助于在H1299和PC9细胞核中时会OCR与菠萝灶二氧化的锌有关，妨碍NNT后OCR减小(布6B)。我们还观察到NNT弱点细胞核中时会饱和脂类和不饱和脂类均大量造就(布6C)。脂类制备所需耗损大量NADPH，而且NNT妨碍后NADPH的有效性减小，于是我们忽视这些脂类总体的减小是由于则有源性脂类摄入量的减小。另则有，我们辨认借助于，NNT弱点细胞核提升了对荧光菠萝灶酸类似物的吸收能够(布6D)。为了口碑NNT妨碍后脂类的造就确实是一个潜在的主因，我们适用饱和脂类菠萝灶酸酯刺激NNT弱点细胞核24小时，辨认借助于NNT妨碍后使H1299和H2009细胞核对菠萝灶二氧化极端(布6E)。此则有，NNT妨碍后特别是在提高了H1299和PC9细胞核对单一不饱和脂类油灶二氧化的极端性(布6F)。鉴于则有源性脂类补充的危害冲击，我们预计细胞核则有脂类耗损将保护措施NNT的遗漏。令人惊讶的是，菌落中时会的脂类耗损加剧了NNT的降至(布6G)。愈来愈不可或缺的是，NNT妨碍后细胞核则有脂类发挥作用时会减小NADPH的耗损(布6H)，这得借助于结论在缺乏则有源性脂类的情况下被迫制备脂类，使NNT弱点细胞核中时会NADPH的有效性减小。总的来说，这些数据库得借助于结论NNT意味著在调节脂类代谢物中时会起不可或缺效用，NSCLC细胞核的脂类代谢物紊乱意味著是一个可运用的弱点。

7 NNT遗漏后叶绿体抑制剂过锌氢蛋白酶(MitoCatalase)挽救Fe-S抗原新功能

Fe-S抗原对小分子氧和愈来愈多危害物质的锌非常极端。虽然我们不会观察到叶绿体抗原抗癌控制系统的锌情况下频发叠加，但这这不排除NNT妨碍后避免的叶绿体ROS充分将这些极端性辅因子锌。为了探究这种意味著性，我们适用了叶绿体抑制剂的过锌氢蛋白酶(MitoCatalase)来提升叶绿体的抗癌能够。我们成功地在H1299、H2009和PC9细胞核中时会过表述了MitoCatalase (布7A)。MitoCatalase的表述也部分减慢了NNT妨碍后相关叶绿体中时会H2O2的消除(布7B)。这与NNT妨碍后气管双链适合于社区活动的减小相对应当(布7C和7D)。另则有，MitoCatalase的表述恢复NNT妨碍后ACO2的活性(布7E)。综上所述，这些数据库得借助于结论，提高叶绿体止痛H2O2的能够可以避免NNT妨碍后Fe-S抗原频发弱点，从而使NNT在避免Fe-S抗原频发锌多方面发挥效用，但对Fe-S簇的转化成自由基无效用。

结论

总之，我们的数据库控制系统性得借助于结论，NNT对白血病生态学具有不可或缺意义，主要是通过调控Fe-S抗原而加强叶绿体代谢物。与以往口碑NNT新功能的数据库控制系统性相异，我们描述了NNT对NSCLC中时会叶绿体锌转化成稳态的微妙冲击。在NSCLC中时会，NNT活性意味著大大降低了大量锌代谢物惹来的锌应当激自由基。我们的辨认借助于实质性得借助于结论了叶绿体代谢物在白血病频发中时会的必要性，解释叶绿体新功能的提升意味著是白血病病人的一个不可或缺靶标。蛋白酶TPH-1对肾保护措施起极为不可或缺，意味著作为病人CKD的潜在病人靶标。

原始借助于处：

Ward NP, Kang YP, Falzone A, Boyle TA, DeNicola GM. Nicotinamide nucleotide transhydrogenase regulates mitochondrial metabolism in NSCLC through maintenance of Fe-S protein function.J Exp Med (IF: 10.892). 2020 Jun 1;217(6):e20191689. doi: 10.1084/jem.20191689.